汉朝政府在取得反击匈奴的胜利后，从元狩二年（前121年）到元鼎六年（前111年），先后在河西走廊设立了武威、张掖、酒泉、敦煌四郡。敦煌郡设于元鼎六年，下辖敦煌、冥安、效谷、渊泉、广至、龙勒六县，包括现在敦煌、安西两市县和肃北、阿克塞两自治县的一部分。
随着河西四郡的设立，河西地区遂渐成为汉王朝经营西域的基地，敦煌则处在经营西域的前哨，又是丝绸之路的咽喉要道。为了保证丝绸之路的畅通，西汉政府除了在敦煌设郡以外，又将长城从令居（今永登）一直向西修筑到玉门关，沿途设置城堡与烽燧，派兵驻守。敦煌设郡后，将酒泉玉门都尉划归敦煌，另设阳关、中部、宜禾等都尉。其中玉门都尉控制着玉门关，阳关都尉控制着阳关。这样，两都尉就分别镇守着南北两条通往西域的丝路大道，保障丝绸之路的畅通及过往商人、使者的安全。在此同时，西汉政府又大量向敦煌移民，改变敦煌地区地旷人稀的状况。据《汉书·地理志》记载，到西汉平帝时，河西四郡共有户71270，口280211，其中敦煌郡有户11200，口38335。事实上，敦煌郡的人口远不止这些，因为西汉政府在大量移民的同时，又从内地征发大量戍卒到河西边塞屯田，从事农耕，所以，如果加上敦煌戍卒的人口，敦煌地区的人口则远远超出史书的记载。农业人口的大量增加，不仅带来了内地先进的生产技术，而且改变了敦煌地区的社会经济结构，汉族成为敦煌地区的主要民族，敦煌也由原来的游牧区变为新兴的农业区。加之水利的兴修，使敦煌地区的社会经济迅速发展。可以说，西汉政府对敦煌的经营与开发，为敦煌成为国际性商贸重镇奠定了基础，如果没有敦煌作为后方基地，汉王朝对西域的开拓经营就难以实现，丝绸之路的畅通也就无法保证。
西汉时期对敦煌的经营及敦煌在丝绸之路上的重要地位，伴随着丝绸之路的畅通，使得东来西去的商人、使臣都要驻足敦煌，从而确立了其作为国际商贸城市的地位。
就国际形势而言，公元前60年，古罗马王国打败了地中海东部的塞琉西王朝，把疆域扩大到地中海东岸，从而成为控制地中海贸易的重要力量。在罗马帝国东部便是波斯的帕提亚王国（我国史书称安息），塞琉西王朝灭亡后，古罗马的疆域同安息相毗连。罗马王国在消灭塞琉西王朝后，试图进一步东进，公元前53年，罗马大军越过幼发拉底河，安息军全力反击，结果罗马军大败。据说在这次战争中，正当双方激战正酣之时，安息军突然展开了无数面用丝绸制造的军旗，这些丝绸旗帜在阳光下鲜艳夺目，光华照人，使罗马军人眼花缭乱。这些丝绸战旗给大多数没见过丝绸制品的罗马军士造成了极其神秘的恐怖心理，使早已厌战而且疲惫不堪的罗马军士无心恋战，加快了罗马军队的失败。这说明正由于安息占据丝路要道，垄断了丝绸贸易，才能利用丝绸作为出奇制胜的武器。就在此次战争后，丝绸开始在罗马上层人物中使用，到罗马帝国时期，丝绸更在罗马贵族中普遍流行。随着罗马帝国经济的发展，丝绸的需求量日益增加，罗马帝国为了夺取东西方的通商路线，不时与安息发生战争，这就使通过安息居间的丝绸及其它物品仍源源不断地运入罗马。
在安息以东的中亚地区，公元1世纪初，占据大夏的大月氏，建立了贵霜王朝。贵霜王朝强大时，其领土包括了中亚河中、阿富汗及印度河流域，西与安息为邻，东部与中国、西域相接。贵霜王朝的兴起，使它成为丝绸之路上的另一个重要国家。贵霜帝国处在东西方的商路上，其统治阶级因贸易而得到很大的利益。这种贸易是带有国际性的。在贵霜王朝时期通过贵霜地境的商路，不但有去中国的，而且也有南去印度的，还有北经花拉子模、阿兰（奄蔡）去东欧的商路。当时的贵霜王朝充当了东西贸易的中介，贵霜王朝统治下的粟特人，则是东西贸易中最活跃的商人。
随着经济的发展和需要，罗马、安息、贵霜诸大国之间，积极开展东西方之间的商业往来和各种交流，这就为丝绸之路的发展创造了条件。公元93年班超派属官甘英出使大秦，到达波斯湾地区，进一步加强了中国同中亚及西方的联系，这些都为丝绸之路的畅通奠定了基础。
东汉时期，由于北匈奴不断侵扰西域，丝绸之路西域段出现了“三通三绝”的情况，但经窦固、班超等人的苦心经营，丝绸之路仍然出现了繁荣的景象。尤其是东汉后期，东汉政府在敦煌设西域副校尉，使敦煌成为经营西域的中心，河西东部由于羌人起义的影响，西域各国入朝的王子、商人大都滞留于敦煌，西域副校尉对此进行了有效的管理。如安定临泾（今甘肃泾川一带）人李恂，安帝中期被任为西域副校尉，驻于敦煌。当时身居此职者，多以各种名目勒索各国的商人使臣，胡商亦多方贿赂各级官员，以期得到更多关照。李恂在任期间，“诸国侍子及督使、贾胡数遗恂奴婢、宛马、金银、香厨之属，一无所受”。在他治理下，丝绸之路“道路夷清，威恩并行”。
东汉时期，敦煌地区已聚集了不少的西域商人。曹魏时期，敦煌成为其控制丝绸之路的咽喉要地，大量的西域商人集中在敦煌，要求进一步加强管理。这里必须提及的是三国时敦煌太守仓慈对丝路的贡献。魏明帝太和中（227年—232年），仓慈为敦煌太守，由于当时西域及外国商胡集中于敦煌，当地的豪强大族经常恃强对西域及外国商人敲诈勒索。有的故意阻拦，不准进入内地；有的压价收买，任意盘剥。仓慈上任后，实行抑制豪强，抚恤贫穷的政策，限制豪强兼并土地，打击了豪强的气焰。仓慈处事公平，对少数民族一视同仁。他鼓励在敦煌的少数民族与汉族通婚，不论“胡女嫁汉”还是“汉女嫁胡”，都受到政府的保护。在商业贸易方面，仓慈对欺行霸市，敲诈西域商胡的豪强，给予严厉制裁；对进入内地的商人，给予热情接待；要到洛阳去的，给他们办理“过所”（通行证），提供方便；愿意将商品就地销售的，由敦煌政府将他们带来的货物全部买下。商人们想买回中原地区的丝绸和其他商品，则由政府用所存货物与他们交换。在他们出境时，派专人护送，以保证其生命财产的安全。这些措施深受当地百姓及外地商人欢迎，“远方异产，悉入敦煌，邻国蕃戎不相征伐”。几年后，仓慈在任上病故，“胡汉悲悼，如丧□妣”，“千人负土，筑坟于此（敦煌）”。当地百姓自发出资为他修庙、塑像，西域商人聚于戊己校尉和西域长史的治所表示哀悼，并为其修建祠堂。
仓慈以后，王迁、赵基、皇甫隆等先后任敦煌太守，他们都能遵循仓慈所立法度，使敦煌继续保持商业贸易的繁荣，直到西晋。魏晋以来，到敦煌的西域商人主要是居住在中亚捷拉夫善河流域以撒马尔罕（康居）为中心的粟特人。粟特人善于经商，长期是中西贸易的中间经纪人，他们到外地经商，有行商，也有伴随商业的发展迁居到外地的坐商。1907年，斯坦因（A·Stein）在我国敦煌西北的汉代长城烽火台遗址中发掘出8封粟特文信札，这些古信札的发现，对丝绸之路历史的研究有着非常重要的价值。关于这些信札的年代考证，中外学者一直存有争议。近年来多数学者倾向于“粟特语古信札”的年代应在4世纪初年（312年—313年）。根据古信札可知，4世纪前后，粟特人在姑臧（武威）、敦煌、金城等地已设有办事处，向内地派往人员进行贸易活动。粟特人从事贸易并非临时的、短距离的贸易，而是跨越东西、贯穿整个丝绸之路的远程贸易。这些远程贸易路途遥远，自然环境极为恶劣，加之沿途强盗或游牧部落经常性的掠夺袭击，以及当地居民的欺骗，使来华贸易的粟特人不仅要结队而行，而且要在沿途重要地区设置据点，建立自卫组织，以保证商人生命财产的安全。英国学者亨宁根据古信札推断，当时在敦煌附近居住的粟特贵族加之他们的家眷、奴仆可达千人左右，这一人数足以使粟特人在敦煌形成自己的聚落。在当时中国内战不断，商贸混乱的情况下，他们仍从“敦煌前往金城去销售大麻，纺织品，毛毡……”并希望“金城至敦煌间的商业信誉尽可能长久保持”以及“派人去敦煌取麝香”。从这些情况中，我们可以肯定地说，4世纪敦煌已成为粟特商人在丝绸之路上的一个重要的货物转运站。这里既有他们准备销往内地的商品，如毛麻织品、马匹、宝石、琉璃等，也有从内地收购到的欲送回撒马尔罕的商品，如丝绸、香料（麝香）、纸等，同时，见多识广、通晓多种语言的粟特商贾在贩卖商品的同时，亦成为传播东西方文化与文明的使者。粟特语信札的出现，充分证明我国史书的记载是可信的，大量中亚粟特人在敦煌进行商业活动，使敦煌到魏晋时期发展为“华戎所交，一都会也”，真正成为丝绸之路上的国际商贸中心。
三国时期人鱼豢所著《魏略》中记述了大秦（罗马帝国）与中国的交往。根据他的记载，这一时期的大秦商人，“常利得中国丝，解以为胡绫”。而这些“中国丝”多得之于安息、粟特等中转商人之手，中国使臣、商人和大秦使者、商人一般难于直接到达双方境内。尤其是安息商人，为了垄断丝绸贸易，素来不愿中国与大秦直接接触，后汉班超派甘英使大秦，也因到波斯湾边，受安息人的阻拦和欺骗，只好怅然而归。
《魏略》中还罗列了大秦出产的物品有金属、珍宝、奇禽、异兽、植物、织品、药材、香料等近百种。鱼豢所记，有的也是因袭前人之说，但三国时对大秦的了解已大大超过了前代，作为居间商的安息商人经陆路到达中国贸易，则是毫无疑问的，因此，这一时期敦煌的商人应该包括安息（波斯）人在内。
西晋末年，北方大乱，各民族统治者先后建立了自己的政权，历史上称这一时期为十六国时期。十六国时期，敦煌先后属前凉、前秦、后凉、西凉、北凉等五个政权。直到北魏灭北凉，敦煌才又重归北方统一政权之下。十六国时期，中原地区割据林立，丝路受阻，但割据河西的前凉等政权，为了取得政治上的支持和经济上的来源，仍然同西域中亚保持着来往，丝绸之路商业贸易活动继续保持发展的势头。
西晋建兴元年（313年），时任凉州刺史的张轨，首先在河西恢复了货币的流通。货币恢复流通后，河西与西域间的贸易随之通畅，西域商品大量流入河西。史载“时，西胡致金胡瓶，皆作拂蒜奇状，并人高二枚”。这里的拂蒜，乃拂棘（拜占庭）之误。前凉张骏（324年～345年）时，在敦煌、张掖、武威等商城设“市长”，专司贸易、过所、商税等事宜。331年，张骏在戊己校尉治地设高昌郡，345年，张骏“使其将杨宣率众，越流沙，伐龟兹、鄯善，于是西域并降”。张骏以敦煌、晋昌、高昌三郡及西域都护等三营为沙州，由杨宣任刺史，州治在敦煌。沙州刺史的设置，表明前凉对西域进行着有效的控制。此后，西域商人不仅来到前凉境内，前赵、东晋境内也有他们的足迹。328年（前凉太元五年），西域诸国献汗血马、火浣布、犁牛、孔雀、巨象及其他珍异200余品。后凉吕纂咸宁二年（400年），有人盗发张骏墓，得真珠帘、琉璃榼、白玉樽、赤玉箫、紫玉笛、珊瑚鞭、玛瑙钟，水陆奇珍，不可胜纪。这些随葬物品，多来自西域，或者安息、大秦，它们都是由商人经敦煌带到前凉统治中心凉州的。
376年，前凉为前秦所灭，河西陇右尽为前秦所有。383年春，在今新疆吐鲁番地区的车师前部王弥真及在今新疆若羌地区的鄯善王休密率领的官员、商人来到长安，要求苻坚派西域都护，统理西域。苻坚遂以弥真、休密为向导，派吕光率7．5万人出发西征。吕光率军经河西走廊，出玉门关，经鄯善和车师境，先后攻下焉耆、龟兹，西域30余国闻风归附，“上汉所赐节传，光皆表而易之”，吕光经营西域，就其规模来说，是汉代李广利以来人数最多，规模最大的一次。吕光的活动本身就是丝绸之路上的一次内容十分广泛的交流。在他返回时，由骆驼带回的各地奇珍异宝两万驮，奇伎异戏、殊禽怪兽“千有余品”，骏马万余匹。可以说，他的这次西征，尽囊西域及西方物产、伎艺，使之东传，对东、西方物资、文化的交流，起了很大作用。
400年，李暠称凉王，建制于敦煌，敦煌第一次成为割据河西的政权——西凉的政治中心。405年，李暠东迁酒泉时，奉表江左，表中论述了敦煌：“郡大众殷，制御西域，管辖万里，为军国之本。”同时，他又“手令诫诸子曰：……此郡世笃忠厚，人物敦雅，天下全盛时，海内犹称之，况复今日”。可见，西凉立国之初，敦煌地区仍然相当繁盛。但自405年李暠东迁酒泉后，西凉统治者集中全力对付东方劲敌，敦煌已不是向西发展的据点。且从西凉东迁到北魏初年，敦煌遭到三次大的冲击。第一次是李鼍东迁时，将前秦时从江汉、中州迁来及武威、张掖以东奔敦煌的人户，“皆迁之于酒泉”；第二次，是421年，北凉沮渠蒙逊攻破敦煌后，“屠其城”；第三次是441年，魏将进攻据敦煌的沮渠蒙逊子无讳，次年“无讳自率万余家，弃敦煌，西就安周”。这三次大的冲击，对敦煌影响很大，正如宿白先生所言：“敦煌经历了这三次大的变动，应该说一次比一次衰微，魏晋以来的繁荣，大约已经消耗得差不多了。”直到不久后，李暠孙李宝从伊吾带领2000多人人据敦煌，缮修城府，安集故民，敦煌才又开始逐渐恢复。
但是，对十六国时期的河西诸政权而言，为了从西域得到政治、经济上的支持，经营西域意义重大。因此各政权都很重视对西域的经营。吐鲁番出土文书中，有不少前凉、西凉、北凉纪年的文书，应是十六国时期经营西域的明证。这一时期，敦煌仍然是经营西域的基地。伴随着对西域的经营，商业贸易也未中断。北凉攻占敦煌后“鄯善王比龙入朝，西域三十六国皆诣蒙逊称臣贡献”。这一时期，武威、张掖、敦煌等地是主要的商贸城市，中亚粟特商人来往各城，商业活动十分活跃。《北史·西域传》载：“其国（粟特）商人先多诣凉土贩货，及（北）魏克姑臧，悉见虏。”
