实验目的
（1）掌握乳酸菌的脱脂乳试管培养方法，熟悉染色的基本技术，识别个体形态特征。
（2）掌握乳酸菌的平板培养方法，识别菌落特征。
实验原理
乳酸菌（Lactic acid bacteria）是一类能利用可发酵糖类产生大量乳酸的细菌的统称。人们利用它产生乳酸的特点，发酵某些食品，以提高产品的适口性或延长保藏期。在普通酸乳与干酪、保健型酸乳与微生态制剂、乳酒与酸乳油等生产中，乳酸菌均起主要作用。例如，利用德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌制作普通酸乳，利用嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌乳脂亚种制作保健型酸乳，利用嗜酸乳杆菌生产乳酸菌素片。目前我国已成功利用嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种与长双歧杆菌4种菌组合，或将嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌与双歧杆菌4种菌组合，混合发酵生产益生菌酸乳。而制作干酪的常用菌种为嗜热链球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种和干酪乳杆菌。本实验介绍这些乳品中常用乳酸菌的培养方法和观察其形态特征的方法。学会识别乳酸菌的形态特征，对菌种的分离与纯化、活化与复壮以及分类鉴定具有重要意义。
由于牛乳是多数乳酸菌的良好培养基，因而常用脱脂乳培养基活化和保藏试管菌种。乳酸菌的平板培养常采用乳清、番茄汁、改良MRS、M17琼脂培养基。通常乳清培养基适合于多数乳杆菌和乳酸球菌生长，改良MRS培养基适合于多数乳杆菌生长，而番茄汁和M17琼脂培养基适合于多数乳球菌生长。由于乳酸菌在平板培养基上长势较弱，因此，接种平板之前要用脱脂乳或MRS液体培养基进行活化，采用活力较高的菌种做平板培养。观察乳酸菌的个体形态常采用革兰氏染色法和甲苯胺蓝染色法。后者是近年来的改进方法，特别适合于对脱脂乳试管培养物的观察。由于菌体呈蓝色，背景牛乳基质呈无色，可以避免牛乳成分对染色的干扰。但缺点是冰醋酸脱色稍有过度，菌体的蓝色变浅而影响观察。
实验材料
（一）菌种
德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp。bulgaricus，Lb）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，La）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，St）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，Lc）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp。cremoris，Llc）37℃，培养8～12h的脱脂乳试管培养物。
（二）培养基
脱脂乳培养基（培养基18）（5mL/管或10mL/管，0.07MPa灭菌20min）或MRS液体培养基（培养基14）、乳清琼脂培养基（培养基17）、改良MRS琼脂培养基（培养基9）、番茄汁琼脂培养基（培养基7）、M17琼脂培养基（培养基15）。
（三）试剂与染色剂
2%冰醋酸、5mL无菌生理盐水、革兰氏染色液、1%甲苯胺蓝染色液。
（四）仪器及其他用品
无菌平皿、特制蜗卷铂耳环、接种环、载玻片、酒精灯、显微镜、体视显微镜、高压灭菌锅、冰箱等。
实验流程
脱脂乳试管活化培养物→菌体染色→菌体形态观察→平板菌落形态观察
实验步骤
（一）乳酸菌的个体形态观察
1.脱脂乳试管培养（菌种活化）
用灭菌蜗卷铂耳环取1～2环（尽量自试管底部取菌）脱脂乳试管原菌种移植于新鲜5mL脱脂乳试管中，轻轻振荡后，于37℃温箱中培养过夜，待乳凝固时取出备用。若不立即使用，应置于4℃冰箱中保存。
2.革兰氏染色法
钩取1～2环乳酸菌脱脂乳试管培养物于载玻片上直接均匀涂片一薄层（也可先滴1小滴生理盐水于载玻片上，再涂片），火焰固定后，用草酸铵结晶紫初染1min，水洗后碘液媒染1min，水洗后95%乙醇脱色60s（为加速脱色要轻轻摇摆载玻片），水洗后沙黄复染1min，水洗和滤纸吸干后用油镜观察。菌体呈蓝紫色，背景牛乳基质呈红色。观察乳酸菌的革兰氏染色特性，判断是阳性菌还是阴性菌。注意观察乳杆菌的菌体长短、粗细、排列方式，乳球菌的球形大小及成对的链状排列方式。
实验注意事项：由于牛乳成分中的蛋白质、脂肪等也被染色，故造成较杂乱的背景，使带颜色的菌体很难区分。因此，在革兰氏染色操作中，脱色的时间应比正常（30s）稍长（60s），若乙醇脱色时间不足或涂片过厚，可造成菌体与背景牛乳基质均呈蓝紫色，不易分辨菌体形态；若脱色恰当（一般以载玻片上的蓝紫色刚好脱掉为宜），牛乳基质呈红色，而菌体仍呈蓝紫色，如此操作容易分辨菌体形态。
另一方法：钩取乳酸菌平板培养的单菌落，生理盐水涂片、革兰氏染色，镜检观察个体形态，可以避免牛乳成分对染色的干扰。
3.甲苯胺蓝染色法
钩取1～2环乳酸菌脱脂乳试管培养物直接涂片，火焰固定后，用1%甲苯胺蓝染色1min，水洗后再用2%冰醋酸脱色1～2s（脱色不宜过度，否则菌体蓝色变浅），水洗后镜检。菌体呈蓝色，背景牛乳基质呈无色。此法与革兰氏染色法相比，无较杂乱的牛乳基质背景，菌体形态、层次十分清晰，染色时间短时不经脱色也可看清菌体。
（二）乳酸菌的菌落形态观察
1.制备平板
将已熔化的无菌培养基冷却至55～60℃，倒入无菌平皿中，分别制备乳清、番茄汁、改良MRS和M17琼脂培养基平板各5套。
2.制备菌悬液
取活化好的脱脂乳试管培养物3～5环移入5mL一无菌生理盐水试管中，或向脱脂乳试管培养物中加入5mL无菌生理盐水，充分振荡摇匀，制成菌悬液后备用。
3.平板培养（制备单菌落）
分别取上述已制备好的上述菌悬液1环，采用平板划线法分别接种于乳清、番茄汁、改良MRS和M17琼脂培养基平板上，倒置于37℃温箱中培养2～3d后，观察菌落特征。
4.菌落特征观察
由于乳酸菌的菌落微小和近于透明，必要时将平皿直接倒置于体视显微镜或低倍镜下观察，同时降低视野亮度至菌落清晰为止。从菌落的大小、形状、表面与边缘情况、隆起程度、透明度、颜色，有无光泽及光滑湿润或粗糙干燥等几方面，观察乳酸菌的菌落特征。
Lb在乳清平板和MRS平板上，用低倍镜观察菌落时，表面呈卷发样或菜花样构造，边缘呈不规则状，有的边缘呈假根样；灰白色，半透明至较透明，微隆起，大小为1～3mm的菌落；老龄菌的菌落边缘整齐呈圆形，表面光滑。
La在乳清平板和MRS平板上，用低倍镜观察菌落时，表面呈凸凹不平的玻璃霜花样，边缘不规则状，有的边缘呈丝状或卷发样；灰白色，半透明至较透明，微隆起的微小菌落。
St、Lc、Llc在乳清平板和MRS平板上，用低倍镜观察菌落时，表面光滑湿润，边缘为整齐的圆形；灰白色，半透明至较透明，隆起的微小菌落。
5.过氧化氢酶试验
用无菌、胶帽滴管吸取少量3%的H2O2溶液滴于乳酸菌的菌落表面，观察有无气泡产生，乳酸菌应为H2O2酶阴性。还可用接种环挑取平板菌落1小环，涂抹于已滴有3%H2O2的干净载玻片上，如有气泡产生即为H2O2酶阳性反应。注意：用于培养试验菌的培养基中不能含有血红素或红血球，否则产生假阳性反应。
实验结果与报告
（1）根据观察结果，按比例大小绘出10～20个典型乳酸菌的形态图，并标明染色反应结果。
（2）按照乳酸菌的菌落特征内容列表描述你所观察到的德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种的菌落特征，并识别和区别它们之间的不同之处。
