1870年，巴甫洛夫带着一张“贫困证明书”进入彼得堡大学攻读生理学。巴甫洛夫在大学期间，学习更加勤奋，一直获得奖学金。正是靠这为数不多的奖学金才使他艰难地完成了大学学业。在大学三年级时，他听了著名解剖学家伊?法?齐昂教授关于生理学的一次演讲，更加激发了他学习生理学的兴趣。他刻苦学习，阅读了大量的书籍，大学毕业时，获得了金质奖章。1875年，他转到军医学院深造，1879年在该院获得硕士学位，1883年获得博士学位，留校任生理学讲师。这一段学习生活对巴甫洛夫来说十分重要，因为他不仅积累了广博的知识，还学会了使用手术刀。
巴甫洛夫生活的年代，科技发展突飞猛进，人类对于自身各个部分的构造已经相当清楚。不过，统一指挥协调躯体各部位运动的“司令部”——大脑，却仍像一个谜团一样困扰着人们，人们急于知道人的大脑和内脏器官的工作原理，了解高级神经活动的规律，却苦于无从观察而进展甚微。一次偶发的事件，让巴甫洛夫大受启发。有个猎人枪支走火，子弹射进了自己的腹部。医生救了猎人一命，但令人遗憾的是伤口长期不能愈合，只好用消毒纱布盖着腹部，留下一个通向胃部的小洞，透过这个瘘管，医生可以清楚地观察到猎人胃部的生理活动情况。由此，巴甫洛夫受到启发：为什么不通过瘘管来观察动物的器官活动情况呢?于是，巴甫洛夫开始了生理学发展史上最有意义的实验。
他把狗的食道切断，把切断的食道两端缝在狗脖子的皮肤上，让狗饿上一段时间。然后，他把饥饿的狗拉到实验室，在它面前放了一盘肉。狗一见肉，便贪婪地吞吃起来，然后咽下去。咽下去的肉掉到了食盘里——因为狗的食道已被切断，肉根本进不到胃里。
但狗仍贪婪而徒劳地吞吃着，四五分钟之后，奇怪的现象出现了，从狗胃里引出的一根橡皮管中流出了大量的胃液。胃液的分泌是狗的第十对脑神经——迷走神经的冲动引起的。巴甫洛夫对狗的迷走神经也动过手术，已在上面引出一根丝线。他轻轻拉动了一下丝线，切断了狗的脑与胃之间的联系。结果，狗尽管还是在不断地吞咽鲜肉，但胃液却停止了分泌。这就是著名的“假饲”实验，它可以使人们收集到胃液并进而研究胃液的分泌机制。
1894年，巴甫洛夫在“海登海因小胃”基础上，制成了保留神经支配的“巴甫洛夫小胃”，并创造了一系列研究消化生理的慢性实验方法（如唾液瘘、食道瘘、胃瘘、胰腺瘘等），利用这些实验方法可以获得关于消化腺分泌全过程和消化液成分的基本材料，能够长期地观察活体动物的正常生理过程，为搞清神经系统对整个消化过程的调节机制奠定了基础，对于营养学和医学有重要价值。为此他获得了1904年诺贝尔生理学和医学奖。他是俄国第一个荣获诺贝尔奖的科学家，也是世界上第一个获得诺贝尔奖的生理学家。
从1903年起，一直到生命的最后一刻，巴甫洛夫连续30余年致力于高级神经活动生理学和大脑生理学的研究，从而发现了大脑皮层和大脑两半球活动的规律，建立了高级神经活动学说，也称大脑皮层的条件反射学说。
这一次，他又开始用狗进行实验。他给一条狗动了手术，在狗的腮上开了个小口，把一根细细的导管安在它的一个唾液腺上。当狗吃东西流唾液的时候，一部分唾液就通过导管流到了外面。
巴甫洛夫通过实验发现，只要食物落到狗的口中，它就会分泌唾液，如果食物是湿的，分泌的唾液就少些；如果食物是干的，分泌的唾液就多些。食物刺激口中的神经导致胃中的一系列反应，这种反射活动是狗和其他一切动物生来就有的，巴甫洛夫称它为非条件反射。这就像灰尘落进眼睛里人会眨眼一样，是与生俱来的反应，不需要任何训练就会产生，动物和人都是这样。
后来，巴甫洛夫又做了一个相当著名的实验：在给狗喂食之前打开电灯，这时狗是不会流唾液的，可是在打开灯以后，紧接着给狗喂食，它的唾液就流了出来。以后，只要是给狗喂食的时候就打开灯，也就是让灯光和食物总是同时出现。这样重复训练多次之后，只要灯光一亮，即使没有食物，狗也会流出口水来，而在重复训练之前，狗对于“开灯”是不会有反应的。巴甫洛夫从这一现象推知，经过了连续几次实验后，狗已经把灯光同食物的出现联系了起来，将“开灯”视作“进食”的信号，因此对灯光像对食物一样产生反应，引发了只有“进食”才会产生的流口水现象。后来巴甫洛夫又发现，除了灯光外，其他的刺激，比如声音等也能引起狗的唾液分泌。巴甫洛夫把这种现象称为条件反射。条件反射是对日常生活经验的总结，“望梅止渴”、“画饼充饥”、看见别人身上起鸡皮疙瘩自己身上也跟着起、看见别人打哈欠自己也跟着打，这些不自主的生理反应均是由条件反射引起的。这证明动物的行为是因为受到环境的刺激，神经和大脑做出反应而引起的。这种功能不是先天就有的，而是后天的训练形成的。这个今天的常识在一个多世纪以前是科学上的一大突破。
巴甫洛夫关于高级神经活动的学说清楚地表述了条件反射活动在争取机体生存的斗争中所具有的生物学意义。人和动物对内、外界环境的适应都是通过非条件反射和条件反射来实现的，非条件反射只能对恒定的环境变化进行适应，而条件反射能够根据对生命活动有利或不利的不同刺激信号，决定其行动，产生精确的反应，使之适应生存的环境，不被淘汰。
从“非条件反射”到“条件反射”，巴甫洛夫经历了漫长而又艰苦的实验过程，他的研究弄清了许多复杂的问题，对生理学和医学的发展都有巨大的贡献。
巴甫洛夫不仅是一位伟大的生理学家，还是一位伟大的心理学家。他把对动物及人脑功能的研究应用到心理学领域，并取得了巨大的成就。他将动物和人的神经类型分为四种基本类型。巴甫洛夫对高级神经活动的研究，开辟了大脑皮层生理学的新领域，奠定了心理学的生理学基础，推动了生理学和心理学的发展。
1907年巴甫洛夫当选为俄国科学院院士，后又被英、美、法、德等22个国家的科学院选为院士。他是28个国家（包括中国）生理学学会的名誉会员和11个国家的十几所大学的名誉教授。1935年，巴甫洛夫以86岁的高龄，主持了在苏联召开的第15届国际生理学大会。
作为一位著名的科学家，巴甫洛夫终生坚持勤奋工作，不懈地进行科学研究，这种有规律的脑力劳动，延缓了衰老，使他健康长寿，直到晚年还以惊人的创造力从事科学研究。
在生命的最后一刻，巴甫洛夫一直密切注视着自己越来越糟糕的身体状况，不断地向坐在身边的助手口授生命衰变的感觉，他要为一生挚爱的科学事业留下更多的感性材料。
巴甫洛夫不仅在科学研究方面给人类留下了宝贵的财产，还留下了一笔珍贵的精神遗产，他以深邃的思想影响着人们的人生态度。他生前曾写有一封致苏联青年的信，其中有着极为深刻的见地和极为诚恳的忠告，并对立志献身科学的青年们提出了殷切希望，他说：“首先要循序渐进，我一谈起有成果的科学工作所应具备的这个重要条件时，总不能不感到心情激动。要循序渐进，循序渐进，循序渐进。你们在攀登到科学顶峰之前，务必把科学的基础知识研究彻底。还没有充分领会前面的东西时，就决不要动手搞后面的事情……科学需要一个人贡献出毕生的精力，假定你们每个人有两次生命，这对你们来说仍是不够的。科学要求每个人有极紧张的工作和伟大的热情。”
