据记载，玛丽王后和国王的感情很深，虽然国王自幼体弱多病，身体浮肿，举步维艰，但玛丽和弗朗索瓦之间仿佛存在着一种超越朋友的感情。然而1560年弗朗索瓦二世横死，玛丽王后结束了在法国的生活，最终回到了苏格兰。
回到苏格兰的玛丽并没感到身份提高带来的优越性。她被各种纷争搞得焦头烂额，然而不可否认的是她有天赋，正如她有野心一样。1565年7月，玛丽出人意料地嫁给了表兄亨利·斯图尔特·达恩利爵士。爵士英俊年轻，风度潇洒，但最有吸引力的是亨利可以在伊丽莎白死后继承英格兰王位。
但婚后玛丽就发现他的丈夫是个好色成性的登徒子，一方面他喋喋不休地要求玛丽赋予他“国王”的称号和实权，另一方面他大肆打击女王的宠臣们，尤其是女王的意大利籍秘书大卫·里奇奥，甚至还纠合苏格兰贵族当着女王的面杀害了里奇奥。这引起了女王的仇恨。
1567年2月9日，正在爱丁堡柯克欧菲尔德宫养病的达恩利爵士被离奇地掐死在花园，而且当晚柯克欧菲尔德宫还发生了爆炸。人们认为这是女王的情人博斯韦尔伯爵所为，但女王纠合了一群支持自己的贵族组织了一次虚假的审判，结果是伯爵本人无罪释放。
可后来发生的事情还是改变了女王的命运。1567年5月15日，女王和被怀疑杀害达恩利爵士的博斯韦尔伯爵在圣十字架宫成婚。这次不得人心的婚姻，使苏格兰贵族们开始公开反对玛丽女王的统治。女王希望通过答应贵族们的要求保全博斯韦尔伯爵，但贵族们没有信守诺言，将女王囚禁在列文湖畔的城堡里，玛丽在这里被迫将王位传给了她和达恩利勋爵的儿子詹姆斯。
1568年玛丽从列文湖城堡逃了出去，她组织了几次未遂的军事政变，之后被迫逃到英格兰寻求她的表姐伊丽莎白一世的庇护，不料她被伊丽莎白软禁在卡莱尔城堡。
1568年5月2日，那时玛丽女王从列文湖逃脱并招募了一支规模不大的军队。当她的军队于5月13日在兰塞德战役被击败后，玛丽便逃往了英格兰。可玛丽女王到了英格兰不久，即于5月19日，又被伊丽莎白德军官囚禁在了卡莱尔城堡。在囚禁期间，她说了那句名言：“In my end is my beginning（我死即我生）。”并将这句话镶嵌在了她衣服的花边上。
在关于玛丽是否应该为谋杀负责的争论结束后，伊丽莎白决定对玛丽采取质询而不是审判来解决问题。1568年10月至1569年1月间，对玛丽的质询在约克进行。这场质询具有极强的政治色彩。伊丽莎白并不希望玛丽被判谋杀罪，而玛丽，因为她曾经受过教会的涂油礼，拒绝承认任何世俗审判的权威性。
詹姆士·斯图尔特·莫里伯爵最终负责对玛丽进行起诉，他同时也掌管玛丽缺位时的苏格兰，其主要任务是不让玛丽返回苏格兰并控制那些支持玛丽的苏格兰人民。
审判的重心逐渐转移到“首饰盒信件”一事上。在爱丁堡一个雕有F字样的银盒里，发现了据称是玛丽写给博斯韦尔伯爵的8封信和许多其他文件，包括玛丽和博斯韦尔的结婚证明。可是，在法庭上玛丽并没有看到这些证物，也不能为自己辩护。她拒绝提交一份书面的抗辩词除非伊丽莎白宣判她无罪，显然，伊丽莎白也不可能那么做。
尽管质询方通过验证笔迹认定首饰盒信件为真迹，其中的内容也摆在那里，如果其中的内容是可信的话，这些都会成为玛丽有罪的证据。但质询方最后得出结论是没有足够的证据证明玛丽是有罪的。于是结果并不出人意料，唯一的结论就是这些都只不过为了取悦伊丽莎白。
后世诸多历史学家质疑“首饰盒信件”的真实性。但原件已于1584年失传了，众多的抄件散失在很多收藏家中但并没有形成完整的一套。玛丽质疑她的笔迹并不难于模仿，并经常流露出这些信札统统都是伪造的，有罪的段落是在质询前嵌入书信中的。或者这些信是其他人写给博斯韦尔的。通过写作风格的对比就能看出它们不是出自玛丽之手。
现在，无论何种方式都不可能证明这些信件的真假了。而除了这些信件，并无其他证据可以控告玛丽。
伊丽莎白认为玛丽图谋染指英格兰的王位并对她造成了威胁。此后玛丽被她囚禁了19年。其中大部分时间，玛丽被软禁在谢菲尔德城堡和谢菲尔德庄园。在乔治塔尔伯特，什鲁斯伯里伯爵六世和他可怕的夫人，哈德威克的贝斯的监视下。他们的女儿伊丽莎白·卡文迪什嫁给了达恩利的兄弟查尔斯·斯图尔特，并育有一女——阿尔贝拉小姐。女王的“至爱”詹姆士·赫伯恩则被囚禁在了丹麦，患上了“精神病”。而说是“神经病”，其实也只是关押他的人是为了给关押他找一个适当的借口而已。最后他死于1578年。
1580年，软禁玛丽的责任被转交到了阿米爱斯伯勒特手中。玛丽在他的“关怀”下度过了余生。
不管如何，1570年，法国国王查理九世派代表劝说伊丽莎白许诺帮助玛丽重新获得她的王位，作为前提条件，玛丽要接受她仍不十分赞同的爱丁堡条约。不过，只有伊丽莎白的代表来与玛丽协商，两位女王则始终没有见过面。
后来，伊丽莎白也不得不重新考虑如何处置玛丽。1572年，议会在女王的鼓励下，订立了一道禁止玛丽成为英格兰女王的法案（即“联合合约”），其目的在于预防任何可能在刺杀女王中得益的继位者。这道法案并不是法令，但数以千计的人在上面签字，包括玛丽自己。
玛丽的囚禁生活足有19年之久。因为这期间反对新教的起义接连不断，直接威胁着新教女王伊丽莎白一世的统治。虽然女王本人希望能够保住玛丽的性命，末了还是被迫下令处决玛丽。
伊丽莎白再也不能容忍玛丽，因为她收到许多报告：有人密谋要害死她本人而让玛丽取而代之。就这样，1587年2月8日玛丽女王在弗斯利亨城堡被处决，其罪名是被怀疑卷入阴谋，企图刺杀伊丽莎白。行刑那天，玛丽身着红色，表明她是一个天主教殉教者。
行刑过程是很残酷的，一些人事后回忆说那天刽子手喝醉之后长喘三口大气才把玛丽的头砍下来，当第一斧头下去，据传她用喉咙喃喃作声说：“刽子手，做完你的事儿！”
关于这场行刑也有很多其他版本，但经久不衰并延续至今的版本是：当刽子手拿着玛丽面容冷峻的头颅向在场的人展示的时候，这才发现玛丽戴了一个假发头套（戴着假发，就像她平时那样）。刽子手抓着一束玛丽的毛发从而能拎着她的头，却发现死去的女王的嘴还对着下面的祈祷者在动。
而另一个事件就是，那时玛丽的小猎犬还躲在她的裙子里，当玛丽被处刑时因为痛苦而逃了出来，反复清洗几次才将粘在它毛发上的女主人的血迹清除。据说那只小猎犬立即被制成木乃伊，现在还保存在大英博物馆。
玛丽最初被埋葬在彼得镇大教堂。1612年，她的儿子，英格兰国王詹姆士一世将其遗体挖掘出来，迁葬到威斯敏斯特教堂直到现在，她的墓穴和她表姑伊丽莎白的只有30英尺之遥。
玛丽死后被封为圣徒，跻身耶稣会殉难者之列，现存还有很多玛丽的遗物。
她的祈祷书长期以来在法国展示，她的辩护书也已出版。在英语刊物中，她所做的十四行诗已经出版，在这本书里据说有她的亲笔。一位着名的德国女演员，亨德尔·席勒茨被玛丽的人生态度所感染并开始钦佩玛丽的为人。据称她所佩戴在脖子上的十字架挂件与不幸的玛丽女王所佩戴的极其相似。
在众多遗物中，很少有确凿证据能证明那就是玛丽女王曾经使用过的。但是还是有一些遗物被证实确实是女王曾经所有的。比如在行刑后覆盖在女王脸上的面纱。这块面纱原本是希彼斯里爵士所有，他声称他母亲是斯图尔特王朝的后代。面纱上金边闪烁的饰物据说是由玛丽女王亲手缝制的，它们整齐地挨个排列着，由此可以形成一个个小的方格。方形地边角镶金。边角相连。
一个木雕证明了这件遗物的真实性。这尊木雕是马提奥戴奥塔夫于1818年，以他形象为蓝本雕成。木雕上面写着：这个面纱是被驱逐了的斯图尔特王朝的传家之宝。被这个家族最后的遗脉约克的天主教枢机主教，亨利·本尼迪克特·斯图尔特保存。
多年以来，亨利·斯图尔特将这件至宝保存在他个人的小礼拜堂里，其中还有诸多其他玛丽女王的遗物。他临死前，将这些遗物，连同一本珍贵的古希腊历史学家普卢塔克着作，和一本精装印制的圣书抄本，还有一些在苏格兰玛丽女王时期铸造的金币，一并赠送给约翰·希彼斯里爵士。
自1818年4月29日以后，这个木雕一直由教皇庇护七世收藏在他位于奎里纳尔山的宫殿内。先前当他住在罗马时曾与约克枢机相厚，当约克枢机和其他枢机于1798年移居威尼斯的时候，英国国王乔治四世，当时的威尔士亲王给予了那些因为法国大革命而生活窘迫的枢机主教一年4，000英镑的养老金。
约克枢机想把这些他认为价值连城的玛丽女王的遗物赠送给那些给他们提供帮助的人作为报答。根据在这个木雕上的纸条上所说，这块面纱长为89英寸，43英寸宽，因而看上去更像是披肩或者围巾而非面纱。
也有人认为，在女王死前这块面纱就被人拿走了。一些人还认为在这块面纱上所记录的是由汉娜·肯尼迪所做的一些着名的描述永别场面的句子：
“接受这块我亲手传递的手帕！这块我在悲伤时刻为你亲手缝制的手帕，交织着我的热泪：它让我永不瞑目。”
