利用基因工程的方法,把我们想要的基因克隆出来,然后从一个植物转到另一个植物,进而实现品种的改良,这样不仅节时,而且又能够很有效地达到既定目标。要实现这一目标,首先要了解植物基因的结构和功能,并能有效的标记、分离和克隆;同时,还要建立高效的转基因系统,成功地将外源基因有效地转移到受体作物中去,实现稳定的整合和表达,并能遗传给下一代。
进入20世纪90年代以来,世界上不少发达国家都纷纷建立了植物基因组研究计划。随着全球植物基因组计划的实施,不少重要农作物的全部DNA序列将被揭示,一些有重要经济价值基因的遗传密码将逐步被解读。目前,模式植物拟南芥的全部DNA序列的测定工作已经完成,玉米已完成了3/4,水稻计划到2003年全部完成,这将为有用目的基因的分离与克隆提供极大的便利,一旦搞清那些与农作物产量、品质和抗逆性相关基因的结构和功能,无疑将会对农作物育种及整个农业生产带来革命性变化。从长花药野隆稻中分离出离抗白叶枯病的Xa21基因,对栽培水稻抗病性的改良的例子就是最好的证明。只有对植物基因组系统地了解,才能不断地分离和克隆更多有用的目标基因。
基因克隆技术
基因克隆技术是基国工程中最基本的实验技术。它的发展和完善推动了基因工程的发展。1972年,美国斯坦福大学的伯格等人首次用限制性内切酶在体外完成DNA的切割,再用DNA连接酶把两种不同的DNA分子连接起来,结果产生了新的重组DNA分子。1973,科恩等人把一段重组的外源DNA片段与载体质料DNA连接起来,并将重组质粒转入大肠杆菌,第一次完整地建立了基因克隆的技术体系。利用这种体系人们成功地克隆了一些有重要应用价值的目的基因,并构建了一些适于在植物上高效表达的载体系统,极大地促进了基因工程改良农作物的进程。目前,人类已克隆了许多可用于农作物遗传改良的有用基因,如与产量有关的高光效基因和与品种有关的贮藏蛋白基因和与抗逆性有关的抗病、抗虫、抗盐、抗旱、抗除草剂的基因。
植物遗传转化技术
植物遗传转化技术又称转基因技术,是基因工程的一个重要组成部分。通常是指人们依据一定的需要,把已经分离和克隆的外源基因,组装成一定的载体形式,借助于物理、化学或生物的手段,转入受体植物细胞,实现在新背景下表达(组织或整株水平)和遗传的过程,为农作物的定向遗传改良和分子育种提供一个有效的技术途径。由于植物细胞表面存在着一层由纤维素、果胶等组成的坚硬的细胞壁外壳,给外源基因的导入设置了一道天然的屏障,直到1971年人们用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁,并将裸露的植物原生质体再生成完整植株后,才为植物转基因工作提供了很好的受体系统。从此,人们开始借助化学药品(磷酸钙、PEG等)诱导外源基因导入植物细胞的研究。受到受体基因型限制,科学家们又开始探索运用物理方法直接在受体细胞上穿孔,使外源基因带入细胞内部,从而发明了显微注射法、基因枪法、激光微束穿孔法、超声波法和离子注入等转基因方法。这些转基因方法虽然很有效,但对受体细胞都会在不同程度上造成一定的损伤。生物介导法的出现,使上述化学、物理介导法的不利方面得到了有效的克服,生物介导法主要是利用自然界存在的叫做“根癌农杆菌”和“发根农杆菌”致癌细菌,这种病菌内存在着一个能引起致瘤的遗传因子即Ti质粒,在感染植物细胞的过程中,Ti质粒上的一段DNA(T-DNA)能被自动整合到宿主植物细胞的基因组中,从而诱变植物细胞的恶性增殖。科学家们对这种T-DNA进行改造,去除致瘤基因,只保留其天然的基因转导功能,从而建立了用农杆菌转化植物细胞的转基因体系。首先,在双子叶植物上获得转基因成功,随着不断的深入研究,在水稻、玉米等重要的单子叶植物上也获得转基因的成功,其方法之简便、效率之高,具有很大的优越性。科学家们成功地运用了上述转基因方法,将已经分离和克隆的有用的外源基因转移到需要改良的农作物品种中,实现了农作物的定向改良,极大地提高了农作物的生产能力,带动传统农业的新革命。
分子标记技术
分子标记技术是基因工程应用于农作物品种改良的又一重要技术。它为在DNA水平上鉴定、区别、定位和跟踪特定的基因和基因组提供了技术可能。过去经典遗传学主要依据对植物外观形态的观察来间接推测其遗传物质的变异,进行遗传分析和性状的跟踪,但由于能够用作形态标记的性状数量有限,往往又存在着显隐性关系和上位性作用,加之重要的农艺性状又通常是多基因控制,极易受环境的影响和干扰,急需寻找一种更为丰富、更为直接的分子标记方法。近年来,分子遗传学的迅猛发展为直接在DNA上进行标记和分析提供了强大的技术支持。最早应用的分子标记便是限制性片段长度的多态性(即RFLP)分析。1980年美国遗传学家Botein首先提出利用RFLP技术构建人类连锁遗传图的构想,而后开始应用于植物;1987年玉米、莴苣和番茄的RFLP连锁图几乎同时问世。
到目前为止至少有20种以上作物已经构建出RFLP连锁图。
由于RFLP分子标记是一个相当复杂的过程,而且周期长,成本高,又往往需要借助对人体健康有危害的放射性同位素进行分析,在应用上有诸多缺点和限制。1990年Williams等根据聚合酶链式反应的原理,利用随机引物扩增基因组DNA直接揭示多态性获得成功,从而建立了RAPD标记技术。
这种分子标记技术较之RFLP标记技术更为方便和灵敏,但稳定性和重复性欠佳。科学家们又结合RFLP和RAPD的优点,发明了AFLP标记技术和微卫星标记技术(SSR),从而大大拓宽了用DNA分子标记的应用领域,人们不仅可以借助于这些标记技术的帮助去分离和克隆基因,还可以用之于目标基因的定位、跟踪并进行分子标记的辅助选择,从而聚合一些有利的基因,培育高产、优质、多抗的新品种。另外,这些分子标记技术也可能用作种性的区别和鉴定,检测种子的真假和纯度。尤其是综合利用这些分子标记技术去构建DNA的连锁图,对育种学家进行分子水平上的育种非常有意义。以水稻为例,通过全世界科学家的共同努力,已经构建其详细的物理图谱和遗传图谱,把2 000多个不同的分子标记定位到水稻的基因上,并利用这些标记定位了一些有重要经济价值的基因,尤其是控制农作物产量和品质的QTLs基因群。
上述基因工程技术在育种上的综合应用,就构成了分子育种的技术体系,随着研究的不断深入,一场新的绿色革命正在到来,它将在以下几个方面形成突破。
(1)农场变药厂。美国科学家们正试图在玉米和烟草中生产抗体、疫苗、胰岛素或维生素源。并通过水培从根系分泌出来或者直接制成营养保健品和保健药物。过去我们许多药物都是通过化学合成或者发酵制成,也有利用动物生产抗体,这3种方法都不方便且价格昂贵。用植物充当制药厂,不仅成本大大降低,而且使人们在食用植物产品的同时,又治疗了某些疾病。如目前美国科学家正在培育能够降低胆固醇的节食型玉米,这种玉米培育成功将使世界5亿胆固醇偏高者受益。
(2)超高产育种。科学家们正在利用分子标记手段,把不同农作物重要农艺性状的QTLs基因进行精确定位,而后利用分子标记下的辅助选择,聚合高产基因。美国康奈尔大学的科学家用分子标记技术深入研究野生稻,发现第一染色体和第二染色体上分别存在着与杂种优势密切关联的两个QTLs,能够使杂种水稻(与栽培水稻杂交)产量水平提高36%,为进一步利用杂种优势的潜力展示出诱人的前景。更令人振奋的是美国华盛顿州立大学的一个研究小组把C4植物的高光效基因(NADP-ME,NAD-ME和PEPC)成功地导入C3植物水稻中去,成倍地提高了受体水稻品种的光合效率,有效地降低光呼吸作用,这对水稻、小麦等C3粮食作物的超高产育种具有重要意义。
(3)抗逆性品种的培育。通过抗病、抗虫、抗寒、抗旱、耐盐等一些抗性基因的克隆和转基因实用化开发,已经育出或正在育出一批抗逆性强的新品种。目前,在全世界范围内推广的抗虫棉就展示了巨大的经济价值。Xa21转基因水稻有效地抵御白叶枯病的危害也显示了诱人的商业价值。更重要的是通过培育这些抗性品种,减少农药的使用和对环境的污染,生产出真正的绿色食品。