在军事上，日伪军还采取了对抗日联军第1路军进行长期封锁和分割包围的办法。他们别出心裁地组成了“出击队”、“游击队”、“警防队”、“挺进队”。“特搜班”等对付抗联的部队专门在空军飞机的配合下，采用“陆空呼应”战术、“踩踏战法”和狗蚊子战术，到处搜寻抗联部队，一旦发现抗联的踪迹，就在飞机的引导下穷追不舍，对抗日联军进行分区围攻。日伪军为了追捕杨靖宇，还专门组成了“富森工作队”、“程斌挺进队”、“唐振东挺进队”、“地方工作班”等４支部队，富森工作队由富森警备科长全面指挥，督励统辖程、唐挺进队，这４支部队呼应合作，实施特别工作。
在政治上，日伪军继续采取诱降政策，改变了过去处死抗联战俘的做法，千方百计地对其进行“宣抚”，招降纳叛，动摇瓦解抗联部队的军心，切断人民群众与抗日联军的联系。除此之外，日伪军对出入集团部落的人，进行指纹对证盘查，发现可疑迹象，就以“通匪”论处。
在经济上，日伪军继续大搞“归屯并户”，实行更为严密的经济封锁。日军要求在“集团部落之外绝无家屋，食宿之处所一律捣毁”，平时配给老百姓的粮食不超过３天，千方百计断绝抗日联军的粮食和服装来源。
在这种情况下，东南满的抗日斗争形势越来越严峻，抗联战士不得不进入深山密林之中，游击区缩小了，他们在极度艰难的处境下坚持抗日斗争。为了粉碎日伪军新的“讨伐”阴谋，１９３９年１０月１日至５日，杨靖宇、魏拯民等抗日联军将领来到桦甸县头道白河，召开中共南满省委和第1路军主要领导人会议。这次会议决定，为了保存实力，免遭日伪军的歼灭性打击，各部队化整为零，编成小分队分散游击。会后，杨靖宇率领警卫旅及第1方面军共８００多人，在桦甸县夹皮沟、蒙江县（今靖宇县）瓮圈、六条河沿和金川县回头沟等地积极活动，牵制日伪军，使第1路军其他部队能够顺利转移。
杨靖宇担任第一路军的总司令兼政治委员，和战士一样过着清苦的生活，战场上和大家一起打仗，生活上从来不搞特殊化。反“讨伐”斗争，由于日伪军追踪很紧，封锁很严，杨靖宇经常饿着肚子打仗。部队没有粮食的时候，战士们吃树皮、草根，杨靖宇总司令也吃树皮、草根。
一天，杨靖宇对几名战士说：今天我们改善一下生活，你们去牵几匹马来。注意，你们要牵马屁股上烙了字的，那是敌人的马，千万不要牵老百姓的马。
几名战士受领任务以后，当天夜里就牵回来几匹带字的马，杀了大家吃马肉。那时候，由于部队经常吃马肉，有一些战士拉肚子，杨靖宇总司令也发高烧了。事务长知道后，就用面袋底的那点面粉烙了两张饼，让警卫员送给杨靖宇。
杨靖宇间到饼的香味，笑了。他正要伸手，忽然转过头问警卫员：这饼是哪儿来的？
警卫员说：事务长烙的。
大家都有吗？
警卫员支吾了好半天，说：就剩下这么点儿面了，照顾一下你的身体。
杨靖宇听后，把饼一推，说：同志，在困难的时候，最重要的是要想着大家，好好照顾同志们，他们行军打仗，流血负伤，太辛苦了。我不能和他们吃两样饭，你把饼送给伤病员。
伤病员听说这是杨司令送来的饼，谁也不肯吃。杨靖宇让警卫员把饼切成条，放到锅里煮了煮，让大家都吃一点。
１２月２４日，抗联指战员在临江县板石沟与伪军激战后，警卫旅与第一路军的部队分开了。１２月底，警卫旅在蒙江县的七号桥伏击伪军，把伪军的二个连歼灭了。
１９４０年初，杨靖宇率领部队回到了蒙江县。为了筹措给养，警卫旅袭击了龙泉镇，龙泉镇是日伪军在蒙江县的一个重要据点。这次战斗，虽然攻克了龙泉镇，歼灭日伪军近百人，缴获了一些粮食和物资，但也暴露了部队的行踪。这以后，伪通化省警务厅长岸谷隆一郎亲自坐镇蒙江县，调集了日军大原、有马、渡边等部队，伪军步兵第三团和９个警察大队，１个森林警察大队，共４万多人，组织多支“讨伐”队，跟踪追击，决心围歼杨靖宇指挥的这支抗日联军部队。
１月底，杨靖宇身边的部队只有６０多人了。为了摆脱日伪军的追击，警卫旅主力北上桦甸，杨靖宇率领一支６０多人的小分队在蒙江、辉南之间的山区转战５０多天，连续作战３０多次。
战斗环境越来越险恶了。森崎实所着《东边道》一书记述当时的情景时，有这样一段话：“在这样急追中的杨司令，至今年１月止，仍拥有２００名左右的直系匪。讨伐队急迫，飞机讨伐，毫不间断，因此粮食补充渐趋困难，严寒袭人。其匪数在２月上旬，在杨周围的人，仅仅分散为１６名，中旬只有８名。他虽然如此，并未放弃再建的希望”。
就在日伪军万般无奈的时候，警卫旅第一团参谋丁守龙参加１月２１日蒙江县马家东南方一场战斗时，负伤被俘了。丁守龙是警卫旅中掌握杨靖宇行踪的重要人物，在敌人的诱惑下，丁守龙叛变投敌，供出了杨靖宇以及抗日联军的行动机密。
日伪军得到丁守龙的口供后，如获至宝，立即调集部队，一次又一次地进行拉网式的大搜捕。杨靖宇率领指战员左冲右打，巧妙应战，但是，由于日伪军布置了多道封锁线，始终无法摆脱敌人，部队遭到很大的伤亡。
最困难的时候，又出现了一个叛徒。２月1日，杨靖宇率领的１０多人在蒙江县西部一处高地与日伪军遭遇，战斗中，警卫队机关枪队队长张秀凤携带现金、手枪和一些文件，向“讨伐”队投降了。张秀凤从１５岁起就跟随杨靖宇，是杨靖宇把他抚养成人的。这一来，日伪军基本掌握了杨靖宇率领的部队的活动地域。
２月１５日，杨靖宇身边只有６名战士了。这天晚上，杨靖宇命令警卫员黄生发等４名负伤的战士迅速转移，他带着另外２名战士继续前进。
２月１８日，２名战士去寻找食物时，在大东沟屯附近遇到了日伪军的特别搜索队，他们被日伪军包围后，在激烈的枪战中壮烈牺牲了。日伪军在搜查他们的尸体时，发现他们带有杨靖宇的印签和手枪、表、口琴等物品，据此，日伪军判断杨靖宇可能就在附近，命令部队进行更仔细更严密的搜索。
杨靖宇当时患了感冒，他只身一人，忍着饥饿和疲惫，继续与日伪军周旋。日伪军一时找不到杨靖宇的居住处，但他们判断，杨靖宇断粮多日，一定会出来寻找粮食的。这时候，日伪军采取了一种十分毒辣的手段，他们让“讨伐”队的特务装扮成老百姓，带上干粮，到附近山林中去打柴，诱惑杨靖宇，再集中兵力围攻。
一天过去了，这些进山的特务一无所获。接连数天，特务们走遍了各山林，都失望了。２月２３日，杨靖宇只身与日伪军周旋已经５昼夜了。这天下午３时，杨靖宇在蒙江县保安村三道崴子看见几个打柴人，上前说：我饿得慌，请你们拿些吃的东西给我，还要衣服，我给你们钱。
这几个打柴人一打量面前的人，就猜想这个长脸大眼、穿着朝鲜草鞋的人就是杨靖宇，就是他们日夜要追捕的人。可是，当杨靖宇真的站在他们面前时，他们又不敢动手了。他们答应着，转身走了。
杨靖宇觉察到对方的神色不对，拔腿就走。但是，已经来不及了，只一会儿工夫，数百名日伪军层层包围过来。
杨靖宇手拿双枪，在密林里冷静应战，打死了不少日伪军。
这场战斗一直持续了２０多分钟，日伪军人多势众，却始终无法接近杨靖宇。
突然，一颗子弹击中了杨靖宇的左手，手中的枪掉下来了，杨靖宇忍着剧痛，用右手继续射击。又一颗子弹袭来，打中了杨靖宇的前胸……
战斗结束了，杨靖宇这位民族英雄为自己的祖国流尽了最后一滴血，时年３５岁。
