全血、血清、血浆样品可用于HIV抗体检测。
(四)操作步骤
1.采样前准备。根据检测项目的具体要求,确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法,按照临床采血技术规范的要求操作,遵守生物安全要求(参见本规范第八章实验室生物安全)。
要检查所需物品是否已备齐,是否在有效期内,有无破损,是否足量,特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致,并注明样品采集时间。选择合适的室内(外)采血空间,受检者坐(卧)于合适的位置,准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。
①样品的编码和记录。应制定样品编码的标准操作程序(SOP),规定样品编码的原则和方法,为样品制定唯一性编码(编号),保证其唯一性。
②采血前,先对装有样品的离心管或滤纸进行标记,核对后编码。要将标签贴在试管的侧面,最好使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。
③应使用专门的样品记录本或登记表记录样品,同时录入电脑保存。
2.采集和处理样品。
①血液。a.抗凝全血:消毒局部皮肤,用加有抗凝剂(EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠)的真空采血管抽取适量静脉血,或用一次性注射器抽取静脉血,转移至加有抗凝剂的试管中,轻轻颠倒混匀6~8次,备用。b.末梢全血:消毒局部皮肤(成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指。1岁以下儿童采用足跟部)。用采血针刺破皮肤,用无菌纱布擦掉第一滴血。收集滴出的血液,备用。c.血浆:将采集的抗凝全血1500~3000r/min离心15min,上层即为血浆,吸出置于合适的容器中,备用。d.血清:根据需要,用一次性注射器(或真空采血管)抽取5~10ml静脉血,室温下自然放置1~2h,待血液凝固、血块收缩后再用1500~3000r/min离心15min,吸出血清,置于合适的容器中,备用。
3.样品的保存。
①用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品,短期(1周)内进行检测的可存放于2~8℃,一周以上应存放于-20℃以下。
②艾滋病检测筛查实验室检测的筛查阳性样品应及时送确证实验室,筛查阴性样品,可根据具体需要决定保存时间,建议至少保存1~2个月。特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。
③艾滋病检测确证实验室收到的筛查阳性样品,无论确证结果如何,均应将剩余的样品保存至少10年,特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。
4.样品的运送。
①应符合生物安全要求;要获得相关部门批准并由具有资质的人员专程护送。
②应采用三层容器对样品进行包装,随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。
送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息,并应放置在第二层和第三层容器之间。a.第一层容器:直接装样品,应防渗漏。样品应置于带盖的试管内,试管上应有明显的标记,标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料,以免碰碎。b.第二层容器:容纳并保护第一层容器,可以装若干个第一层容器。
要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。c.第三层容器:容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签,注明数量、收样和发件人及联系方式,同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样,还应易于消毒。d.用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送。e.运送样品必须有记录。f.特殊情况下经有关部门批准可以用特快专递邮寄样品,但必须按三层包装,将样品管包扎好,严禁使用玻璃容器。
5.样品的接收。
①样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内,由经过培训的、穿戴防护衣、戴口罩、防护眼镜的工作人员在生物安全柜中打开,用后的包裹应及时进行消毒。
②核对样品与送检单,检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出,对样品管和盛器消毒,同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。
③检查样品的状况,记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。
如果污染过重或者认为样品不能被接受,应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知送样人。
④接收样品时应填写样品接收单。
二、HIV抗体检测
(一)范围
本章规定了HIV抗体的检测方法、程序、结果报告、检测策略及质量控制。适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。
(二)规范性引用文件
《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》(中华人民共和国卫生行业标准,WS293-2008)GuidanceforHIVtestingintheWesternPacificRegion.WHODraft19,July,2008.StatementfromtheSurveillanceandSurveyWorkingGroupandtheLaboratoryWorkingGrouptotheOfficeoftheGlobalAIDSCoordinator.26Nov.2006.GuidelinesfortheuseoftheBEDassayforincidenceestimationandsurveillanceinresourcelimitedcountries.Atlanta,5June,2006.RevisedGuidelinesforHIVCounseling,Testing,andReferral.U.S.CDC,2001.CurrentHIV-2diagnosticstrategyoverestimatesHIV-2prevalenceinChina.JournalofMedicalVirology,2009,81:790-797.(三)HIV抗体检测实验室要求应符合《全国艾滋病检测工作管理办法(2006)》中对实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。
实验室的质量保证和实验室安全防护按本规范相关章节规定执行。
(四)HIV抗体检测的目的和要点
1.HIV抗体检测的目的。
(1)HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。
(2)以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况,包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。
(3)以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV,包括献血员筛查和原料血浆筛查。
(4)以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势,包括各类高危人群、重点人群和一般人群。
2.HIV抗体检测的要点。
(1)根据目的选择检测方法及检测策略。
(2)严格遵守实验室SOP。
(3)筛查试验阳性,须作确证试验。
(4)筛查试验阴性,不应做确证试验。
(5)筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。
(五)以诊断为目的的检测策略
1.常规HIV抗体检测的方法和程序。HIV抗体检测分为筛查试验(包括初筛和复检)和确证试验。
(1)筛查试验。
①筛查试剂。必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂,其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。
②筛查样品。HIV抗体筛查可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液样品。
③筛查方法。a.酶联免疫吸附试验(ELISA)。可使用血液、唾液、尿液样品,ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体,加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体,加底物显色,用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。b.化学发光或免疫荧光试验。这类试剂采用发光或荧光底物,既可检测抗体,也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体,加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体,加发光或荧光底物,用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。c.快速检测(RT)及其他检测试验。这类试验简便快速,适用于应急检测、门诊急诊检测。一般可在10~30min内得出结果。
明胶颗粒凝集试验(PA):是HIV血清抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体,与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时,明胶颗粒与抗体发生凝集反应,根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验必须有阴性和阳性质控。
免疫渗滤试验:斑点ELISA和斑点免疫胶体金(或胶体硒)快速试验:均以硝酸纤维膜为载体,HIV抗原点状固定在膜上,加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10min以内。有效试验的质控点必须显色。
免疫层析试验:以硝酸纤维膜为载体,HIV抗原线状固定在膜上,待检样品(血液或唾液)沿着固相载体迁移,阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。
(4)筛查程序。
①初筛试验。根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测,对呈阴性反应的样品,可出具HIV抗体阴性(-)报告;对呈阳性反应的样品,需要进一步做复检试验和确证试验。
②复检试验。对初筛呈阳性反应的样品,应使用原有试剂和另外一种不同原理(或厂家)的试剂,或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂,则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如两种试剂复检均呈阴性反应,则报告HIV抗体阴性(-);如均呈阳性反应,或一阴一阳,需送艾滋病确证实验室进行确证试验(图9-1)。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应,而抗体试剂检测为阴性反应,则应考虑进行HIV-1p24抗原或核酸检测,必要时进行随访。
艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品,确证实验室可以直接进行确证试验。
③初筛和复检流程见图9-1。
④筛查试验结果的报告。HIV抗体筛查试验用附表1进行报告,阴性反应报告为“HIV抗体阴性(-)”;阳性反应报告为“HIV抗体待复检”。
(5)筛查试验呈阳性反应样品的转送。如需送上级实验室进行复检,需要核对身份,补充个人信息(如姓名和身份证号码),必要时采集第二份血样,持HIV抗体筛查报告,送当地艾滋病筛查中心实验室,或直接送确证实验室复检。HIV抗体复检试验用附表专用表格2进行报告,两次检测均阳性或一阴一阳报告为“HIV抗体待确证”;两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴性(-)”。HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。
①先用第一种筛查试剂(高敏感性)检测,出现阴性反应报告HIV抗体阴性;出现阳性反应则报告“HIV抗体待复检”,用第二种筛查试剂复检。
②第二种筛查试剂(高特异性)复检,出现阴性反应进行确证试验;出现阳性反应用第三种筛查试剂进行确证。
③第三种筛查试剂(高特异性ELISA)检测结果阴性,则报告HIV抗体阴性;检测结果阳性,且S/CO比值大于或等于6.0者,可以出具“HIV-1抗体阳性(+)”报告,使用“HIV抗体替代策略检测报告单”(附表4)。ELISA试剂检测结果阴性或S/CO在1.0~5.9,须进行确证试验。按照确证试验结果报告。
(6)以监测为目的的检测策略。
①适用范围。全国艾滋病疫情监测。
②检测程序及结果报告(见图9-3)。a.先用第一种筛查试剂(高敏感性ELISA)检测,出现阴性反应报告“HIV抗体阴性(-)”。出现阳性反应则用另一种不同原理或不同厂家的筛查试剂(高特异性ELISA)复检。b.初筛和复检均为阳性,且样品OD值与临界值(Cutoff)的比值(S/CO)均≥6.0者可作阳性考虑,上报疫情;初筛与复检任何一种试剂检测结果S/CO比值在1.0~5.9,或复检结果出现阴性反应,应进一步作确证试验,按照确证试验的标准判断结果(见图9-3)。
c.发放检测报告的同时上报疫情。d.对报告阳性者做好检测后咨询。e.本程序仅用于流行病学监测和无关联检测,结果不得报告给个人。
(7)以血液筛查为目的的检测策略。参照血液系统相关规定执行。
(8)艾滋病检测实验室检测信息上报。各级艾滋病检测实验室所在机构每月应填写《HIV抗体检测数及阳性人数统计报表》,并于每月10日前完成网络直报。未开展网络直报的单位,由县级疾病预防控制机构收集信息后统一上报。
三、实验室生物安全
(一)范围
本章规定了艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防。适用于全国各级各类艾滋病实验室的安全防护和职业暴露预防。
(二)规范性引用文件
《医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则(试行)》中华人民共和国卫生部,2004年5月31日颁布,2004年6月1日起实施。
《实验室生物安全通用要求》GB19489-2008,2009年7月1日起实施。
《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则(WS233-2002)》中华人民共和国卫生行业标准,2002-12-03发布,2003-08-01实施。
GuidelinesfortheSafeTransportofInfectiousSubstancesandDiagnosticSpecimens.WHO,1997.《消毒技术规范(2002年版)》中华人民共和国卫生部2002-11-15发布,2003-04-01起实施。
(三)HIV的生物危害
第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。人类免疫缺陷病毒(HIV)属第二类病原微生物,是高致病性病原微生物。
(四)HIV相关检测的生物安全级别
1.HIV抗体检测(包括筛查和确证实验)、抗原检测和相关的免疫学检测应在符合Ⅱ级生物安全实验室(BSL-2)要求的艾滋病检测实验室中进行。
2.HIV分离培养、浓缩、中和试验、细胞培养及研究工作及其他需要应用活病毒的研究工作,应在Ⅲ级生物安全实验室(BSL-3)中进行。
3.HIV核酸提取和检测均应在符合Ⅱ级生物安全实验室(BSL-2)要求的艾滋病检测实验室中进行。